蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。蛋白質(zhì)主要用于維持、生長(zhǎng)、妊娠和泌乳等需要。因此蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)成為一項(xiàng)日常性且必需性的工作。蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法有微量凱氏定氮法、雙縮脲法、folin―酚試劑法、考馬斯亮蘭法、紫外吸收法等。接下來(lái)遠(yuǎn)慕生物帶你一一了解。
蛋白質(zhì)含量測(cè)定的幾種方法
1.紫外分光光度法
蛋白質(zhì)分子中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，使蛋白質(zhì)對(duì)280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光值與其濃度成正比，可作定量測(cè)定。該法操作簡(jiǎn)單、快捷，并且測(cè)定的樣品可以回收，低濃度鹽類不干擾測(cè)定結(jié)果，故在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛被采用。但此方法存在以下缺點(diǎn)：
1.當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基含量差別較大會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，故該法適用于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的樣品。
2.若樣品中含有其他在280nm吸收的物質(zhì)如核酸等化合物，就會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分別測(cè)定280nm和260nm兩處的光吸收值，通過(guò)計(jì)算可以適當(dāng)?shù)南怂釋?duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾作用。但因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不同的，雖經(jīng)校正，測(cè)定結(jié)果還存在著一定的誤差。
2.Bradford法
1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，是一種能夠迅速并且準(zhǔn)確的定量蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變?yōu)?95nm。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度(最低檢出量為1μg)。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過(guò)程，大約只需2min，結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽(yáng)離子(如K+，Na+，Mg2+、)、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過(guò)用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。
總氮量的測(cè)定——微量凱氏定氮法：當(dāng)被測(cè)定的含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱消化時(shí)，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮與硫酸化合成硫酸銨。由于分解反應(yīng)進(jìn)行得很慢，故可加入硫酸銅和硫酸鉀或硫酸鈉，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點(diǎn)，氧化劑(過(guò)氧化氫)也能加速反應(yīng)。
消化終止后，在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸氣蒸餾，將氨蒸入過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸溶液中，全部蒸完之后，用標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸溶液滴定收集的氨量，準(zhǔn)確測(cè)定氨量，從而折算出蛋白質(zhì)含量。
3.雙縮脲法
具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與Cu2+絡(luò)合呈紫紅色，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用比色法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算可以確定蛋白質(zhì)濃度。
4.Folin-酚試劑法
測(cè)定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，它是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。它操作簡(jiǎn)單、迅速、靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成，試劑A相當(dāng)于雙縮脲試劑。蛋白質(zhì)中的肽鍵與試劑A中的堿性硫酸銅反應(yīng)形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物可與試劑B中磷鉬酸-磷鎢酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)。由于磷鉬酸與磷鎢酸易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)。而蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸均可發(fā)生此呈色反應(yīng)。顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
此法易受蛋白質(zhì)樣品中酚類化合物及檸檬酸的干擾。另外，試劑B中的磷鉬酸-磷鎢酸僅在酸性pH值時(shí)穩(wěn)定，故在將試劑B加入到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液時(shí)，必須立即混合均勻。以確保還原反應(yīng)能正常發(fā)生。此法也適用與酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。
5.微量凱氏定氮法
含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。
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