大腸桿菌是生物領(lǐng)域最常用的工程菌之一，具有生長速度快、培養(yǎng)成本低、基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善等優(yōu)勢，其質(zhì)粒常被用作基因工程中的載體，在基因的分子克隆、疫苗研發(fā)、重組蛋白類藥物的表達和生產(chǎn)等領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用，但同時需要嚴格控制相關(guān)生物制品中內(nèi)毒素的殘留水平。
1、內(nèi)毒素簡介
內(nèi)毒素位于革蘭氏陰性菌細胞壁的最外層，覆蓋于細胞壁的黏肽上，化學(xué)成分是磷脂-多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要毒性成分是脂多糖(LPS)中的類脂A，只有當菌體死亡溶解或者用人工方法破壞菌體細胞后內(nèi)毒素才釋放出來。
內(nèi)毒素能夠直接作用于人體，通過與宿主細胞上的Toll樣受體（TLR）結(jié)合激活組織內(nèi)的炎性細胞及炎癥因子，導(dǎo)致機體發(fā)熱并產(chǎn)生全身炎癥性反應(yīng)，繼而引起彌散性血管內(nèi)凝血、休克、多臟器功能衰竭等嚴重的病理生理癥狀，又稱之為“熱原”。內(nèi)毒素具有極強的生物活性，即使是微量也會引起機體的各種炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。
內(nèi)毒素還具有較好的耐熱性和穩(wěn)定性，在60℃的溫度下加熱數(shù)小時也不會被破壞，完全滅活需在180℃高溫下加熱3小時以上，一般的化學(xué)藥品也不會影響細菌內(nèi)毒素的活性，只有強酸、強堿或強氧化劑可以破壞其結(jié)構(gòu)。
2、內(nèi)毒素的檢測方法
內(nèi)毒素可以與特定的檢測試劑發(fā)生反應(yīng)，基于這一原理開發(fā)出內(nèi)毒素的檢測方法。常見的檢測方法包括凝膠法、重組C因子法、動態(tài)比濁法等。
鱟試劑中的C因子是對內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠與內(nèi)毒素結(jié)合并被激活，從而啟動整個鱟試劑血凝級聯(lián)反應(yīng)，凝膠法根據(jù)該原理來檢測內(nèi)毒素，并通過觀察有無凝集素形成作為反應(yīng)的終點。該方法簡便易操作且不需要使用光學(xué)檢測儀，但檢測范圍存在一定的局限性。
鱟試劑的制備需要捕捉大量的鱟并抽取其血液，隨著對鱟的保護以及重組技術(shù)的發(fā)展，新一代人工合成的重組C因子開始被用于內(nèi)毒素的檢測中。重組C因子被內(nèi)毒素活化后能夠與熒光底物作用產(chǎn)生熒光信號，熒光信號強度與內(nèi)毒素濃度成正比關(guān)系，可據(jù)此來測定內(nèi)毒素含量。該檢測方法不存在G因子旁路干擾，具有較高的特異性，可用于含有β-葡萄糖干擾的樣品檢測。
動態(tài)比濁法可通過光學(xué)測定儀測定反應(yīng)混合物達到預(yù)定OD值所需時間和濁度變化的速率，檢測數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量，還能起到風險預(yù)警作用。
3、內(nèi)毒素的去除方法
由于內(nèi)毒素具有顯著的危害性，F(xiàn)DA等法規(guī)也對內(nèi)毒素控制提出明確要求。首先要從源頭消除外源性內(nèi)毒素污染，在生物藥物研發(fā)及生產(chǎn)過程中，要確保與樣品直接接觸的設(shè)備、容器、儲液袋、原輔料、耗材等經(jīng)過嚴格消毒滅菌處理。其次對于樣品本身就存在的內(nèi)源性內(nèi)毒素污染，需要從樣品本身制備工藝角度出發(fā)，尋找合適方法，如離子交換層析法、疏水層析法、特異性吸附等。
離子交換層析法：根據(jù)目標產(chǎn)物與內(nèi)毒素在緩沖液中的帶電性質(zhì)差異，可以利用離子交換層析的方法去除內(nèi)毒素。陰離子交換層析主要通過改變緩沖液的離子強度使內(nèi)毒素分子帶大量負電荷，能夠與帶正電荷的配基結(jié)合，從而將其去除；陽離子交換層析主要采用吸附模式，通過改變緩沖液的pH使帶正電荷的目的蛋白吸附在離子交換介質(zhì)上，帶負電荷的內(nèi)毒素流穿，實現(xiàn)分離。
疏水層析法：內(nèi)毒素在高鹽條件下會聚集成大多不與疏水填料結(jié)合的復(fù)合物，上樣時直接穿透而被去除。或者采取目標樣品流穿模式，在一定鹽濃度下使目的蛋白不與填料結(jié)合而內(nèi)毒素分子可與其結(jié)合，從而實現(xiàn)分離。
特異性吸附：將多粘菌素B偶聯(lián)于層析介質(zhì)上，通過介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素，蛋白因不會被該層析介質(zhì)吸附而隨流動相流出，收集該流出蛋白即可。該方法去除內(nèi)毒素效果較好,但有一定的蛋白損失。
此外，還可以依據(jù)內(nèi)毒素在不同的水溶液中形成的聚集體分子量大小差異，通過凝膠過濾層析和切向流膜過濾技術(shù)等方法將其去除。
