PCR 全過(guò)程包括三個(gè)基本步驟,即雙鏈 DNA 模板加熱變性成單鏈(變性);在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)(退火);在適宜溫度下 Taq DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板,利用4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)催化引物引導(dǎo)的 DNA 合成(延伸)。這三個(gè)基本步驟構(gòu)成的循環(huán)重復(fù)進(jìn)行,可使特異性 DNA 擴(kuò)增達(dá)到數(shù)百萬(wàn)倍。
1、變性
90～94℃的高溫處理可使模板 DNA 雙鏈間氫鍵斷裂,解離成單鏈但不改變其化學(xué)性質(zhì),變性的時(shí)間一般為30s,如果模板的 G+C 含量較高,變性時(shí)間可能延長(zhǎng)。
2、退火
退火的溫度一般降低至25～65℃。在退火過(guò)程中,引物分別與待擴(kuò)增的 DNA 片段的兩條鏈的3'端互補(bǔ)配對(duì)。退火的溫度取決于引物的 Tm 值,并通過(guò)預(yù)備試驗(yàn)來(lái)最后確定。一般引物越短,其 Tm 也越低,對(duì)于10bp 左右的隨機(jī)引物,退火溫度在37℃左右,反之則高。退火溫度越高,引物與模板結(jié)合的特異性增強(qiáng),非特異性的擴(kuò)增概率降低,但擴(kuò)增效率也隨之降低。相反,隨著溫度的降低,引物與模板非特異性結(jié)合的概率提高。引物的長(zhǎng)度越長(zhǎng),其退火溫度則越高,否則會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合,降低 PCR 產(chǎn)物對(duì)模板的忠實(shí)程度。退火時(shí)間一般為30s。
3、延伸
Taq DNA 聚合酶的最適溫度為70～74℃,在此溫度下 Taq DNA 聚合酶以單鏈 DNA 鏈為模板,將單核苷酸逐個(gè)加入到引物的3'端,使引物不斷延長(zhǎng),從而合成新的 DNA 鏈。新合成的引物延伸鏈在下一輪循環(huán)時(shí)就可以作為模板。反應(yīng)步驟的溫度和時(shí)間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自行設(shè)定,一般要經(jīng)過(guò)20～30個(gè)循環(huán),擴(kuò)增產(chǎn)物需要經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
