當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會(huì)被釋放出來(lái)或被激活，使電泳結(jié)果復(fù)雜化，影響zui終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時(shí)盡可能在低 溫下進(jìn)行。此外，許多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持 著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。因此對(duì)于我們想要研究的蛋白來(lái)說(shuō)，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對(duì)于蛋白純化路線設(shè)計(jì)來(lái)說(shuō)顯得尤為重要。
蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復(fù)雜的，通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如 PMSF 和 leupeptin 。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對(duì)某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復(fù)合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”，見(jiàn)下表（來(lái) 自《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》）。
| 蛋白酶抑制劑 | 有效抑制的酶 |
| PMSF ( Pheylmethylsulfonyl fluoride )是很常見(jiàn)的抑制劑，使用濃度為 1mmol/L | 不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。 |
| AEBSF 絲氨酸抑制劑，使用濃度為 4mmol/L | AEBSF 的抑制活性與 PMSF 相近，但它更易溶于水而且毒性低 |
| EDTA，EGTA，使用濃度為 1mmol/L | 通過(guò)鰲合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來(lái)抑制金屬蛋白酶。 |
| 多肽蛋白酶抑制劑，使用濃度為 2-20ug/ml | 亮肽素（Leupeptin）能抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制許多絲氨酸蛋白酶；苯丁抑制劑（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶 |
| TLCk，TPCK，使用濃度為 0.1-0.5mmol/L | 不可逆的抑制絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶 |
| 芐脒（Benzamidine）使用濃度為 1-3mmol/L | 抑制絲氨酸蛋白酶 |
蛋白酶的功能和分類
蛋白酶功能 :
涉及到許多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的過(guò)程:
1.食物蛋白在消化道的消化
2.激活無(wú)活性酶原和多肽激素/神經(jīng)轉(zhuǎn)移介質(zhì)的釋放
3.調(diào)節(jié)血凝物質(zhì)和纖維素
4.內(nèi)源性和外源性蛋白的細(xì)胞內(nèi)消化
5.跨膜的蛋白轉(zhuǎn)移
6.微生物對(duì)生物體攻擊,通過(guò)釋放蛋白酶導(dǎo)致毒性的增加
蛋白酶分類 :
根據(jù)催化中心結(jié)構(gòu)的不同蛋白酶可分為4類:
1.絲氨酸蛋白酶在其活性中心含有絲氨酸和組氨酸，如:糜蛋白酶, 彈性蛋白酶，血纖維蛋白溶酶，凝血酶，枯草桿菌蛋白酶，胰酶 Chymotrypsin, Elastase, Plasmin, Subtilisin, Thrombin, Trypsin
2.半胱氨酸蛋白酶（別名:硫醇或 SH 蛋白酶）在其催化中心含有半胱氨酸，如: Calpain, 組織蛋白酶 B,C 和 L，和木瓜蛋白酶
3.天(門(mén))冬氨酸蛋白酶（羧基蛋白酶）在其活化中心含有天(門(mén))冬氨酸，如: 組織蛋白酶 D, 木瓜蛋白酶, 腎素
4.金屬蛋白酶含有金屬離子，即: 鋅2+在其催化中心，如氨基肽酶，羧基蛋白酶 A 和 B 嗜熱菌蛋白酶
在分離蛋白時(shí)，組織或細(xì)胞裂解液中充滿了來(lái)自溶酶體的酶,并且原來(lái)無(wú)活性的蛋白酶原被充分激活,開(kāi)始消化其周圍的蛋白質(zhì)。為避免此因素，蛋白酶抑制劑必須被 加入在緩沖液內(nèi)以阻止蛋白酶對(duì)細(xì)胞組織的消化作用。來(lái)自哺乳類動(dòng)物，植物，霉菌或細(xì)菌的組織，蛋白酶成分是不同的,并根據(jù)機(jī)體狀態(tài)的發(fā)展蛋白酶也可以發(fā)生變化。哺乳類動(dòng)物組織分離時(shí)比細(xì)菌或其它組織分離時(shí)更需要應(yīng)用蛋白酶抑制劑使組織細(xì)胞受到完全的保護(hù)。
