目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）方法分為染料法和探針法，染料法以SYBRGreen法為代表，SYBRGreen染料游離時(shí)熒光微弱，但但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系，因此熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)步驟可以通過檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA（PCR產(chǎn)物）的量，但該方法沒有特異性，非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。
對(duì)于探針法來說，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法完全不同。
準(zhǔn)品3.jpg)
一、熒光
是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光。
其原理為：光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會(huì)恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會(huì)以光的形式釋放，所以產(chǎn)生熒光。
（紫外驗(yàn)鈔的原理就是利用了經(jīng)漂白處理后的紙張?jiān)谧贤饩€(波長(zhǎng)為365nm的藍(lán)光)的照射下會(huì)衍射出波長(zhǎng)為420460nm的藍(lán)光
二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)
熒光物質(zhì)間存在一種現(xiàn)象，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（稱為供體Donor）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)二者的距離接近到一定程度（1-10nm）供體被激發(fā)光激發(fā)但是卻不發(fā)出該物質(zhì)的發(fā)射光，而是將能量轉(zhuǎn)移至受體，整個(gè)能量轉(zhuǎn)移的過程中由一對(duì)偶極子介導(dǎo)，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅（即供體熒光被受體淬滅）；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體的熒光，并造成次級(jí)熒光光譜的紅移。
三、qPCR探針法的本質(zhì)
目前所有的探針法qPCR的理論基礎(chǔ)都是利用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，探針上存在一對(duì)能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團(tuán)，利用PCR反應(yīng)中的一些過程（酶切，雜交等），使兩個(gè)基團(tuán)的距離產(chǎn)生變化，使系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度或者熒光種類發(fā)生變化，這種變化又與PCR產(chǎn)物的種類和量有直接關(guān)系，通過檢測(cè)這種變化，我們就可以檢測(cè)出PCR反應(yīng)體系中產(chǎn)物的種類和量。
四、幾種qPCR探針法
1、Taq-Man探針：Taq-Man探針法是最經(jīng)典的探針方法，設(shè)計(jì)一條與擴(kuò)增產(chǎn)物能互補(bǔ)雜交的探針，在探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)（供體），在探針3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)（受體），當(dāng)探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離很近（探針長(zhǎng)度）因熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)在入射光激發(fā)下不發(fā)出熒光。PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針雜交在擴(kuò)增產(chǎn)物上，當(dāng)引物介導(dǎo)的延伸反應(yīng)到達(dá)探針位置時(shí)，因taq酶擁有5’-3’的外切酶活性，會(huì)從5‘端切割（水解）探針，從而使5’端的熒光基團(tuán)和3’端的淬滅基團(tuán)分離，使它們的間距超過10nm，超出熒光共振能量轉(zhuǎn)移的范圍，熒光基團(tuán)此時(shí)在合適入射光的作用下，就能發(fā)出自身波長(zhǎng)的熒光。探針雜交是特異性的，所以熒光的種類和量能特異性的代表目標(biāo)產(chǎn)物的種類和量。
近年來對(duì)Taq-Man探針進(jìn)行改良發(fā)展出TaqMan-MGB探針，在Taq-Man探針的3端加入一個(gè)能插入DNA小溝的二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽（DPI3），可以使大大提高探針的TM值，增加雜交反應(yīng)的特異性。
2、雙雜交探針（dualhybridizationprobe）：與Taq-Man法不同，雙雜交探針的供體基團(tuán)和受體基團(tuán)分別在兩條探針上，這兩條探針都可以與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，雜交位置不同但很接近，反應(yīng)時(shí)兩條探針一頭一尾雜交于擴(kuò)增產(chǎn)物上，雜交后兩個(gè)基團(tuán)距離在10nm以內(nèi)（一般1-5堿基），此時(shí)產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，激發(fā)光下供體基團(tuán)不發(fā)光，受體基團(tuán)發(fā)光，檢測(cè)受體基團(tuán)的發(fā)光情況既可以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的情況。
3、分子信標(biāo)探針（molecularbeacon，MB）：分子信標(biāo)探針采用的是在反應(yīng)中增加熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離的方法，和Taq-Man法不同，分子信標(biāo)探針不是采用酶切的方式使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，而是通過雜交的方式改變探針二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加兩個(gè)基團(tuán)的距離從而使熒光基團(tuán)發(fā)光。
分子信標(biāo)探針在與靶序列雜交前呈現(xiàn)一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中環(huán)部分為能與靶序列互補(bǔ)雜交的特異性序列，臂部分互補(bǔ)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別在兩臂的末端，當(dāng)分子信標(biāo)探針呈莖環(huán)狀態(tài)時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離極近，熒光基團(tuán)被淬滅。
當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生靶序列產(chǎn)物，探針環(huán)部分與靶序列發(fā)生雜交，兩臂距離因此拉開，兩個(gè)基團(tuán)間的距離不能形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)發(fā)光。
4、蝎形探針（scorpion）：蝎形探針又叫蝎形引物，因形狀類似蝎子而得名，其基本原理與分子信標(biāo)探針十分類似，不同點(diǎn)在于，蝎形探針3’端帶了PCR引物，反應(yīng)中得到的產(chǎn)物與蝎形探針為一個(gè)分子，探針的雜交在分子內(nèi)部，而不需要兩個(gè)分子參與，從而使雜交反應(yīng)更加迅速，高效。
