在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗 、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染 器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。
驗(yàn)配圖 (1).jpg)
一、防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。
2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3.有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水 沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2 O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水 配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。
6.設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。
二、常用的RNA酶抑制劑
1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合 使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。
2.異硫氰酸胍 ：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3.氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合 形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin ）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
