引物的設(shè)計(jì)和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計(jì)意味著絕對(duì)的失敗。但是，好的設(shè)計(jì)并不等于好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。
3.1 引物退火溫度
引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法——從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時(shí)可以如下進(jìn)行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過5℃，就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
3.2 引物濃度
引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測(cè)量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。
微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計(jì)算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。
一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個(gè)堿基長(zhǎng)的引物，1個(gè)O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計(jì)算出一定的工作濃度下，引物的加水量。
濃度(μM)＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）
舉例：計(jì)算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測(cè)吸光度為0.2。計(jì)算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得：
濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM
3.3 引物、探針的純度和穩(wěn)定性
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長(zhǎng)序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個(gè)循環(huán)過程，在每個(gè)堿基加入時(shí)使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個(gè)循環(huán)都可能失敗。較長(zhǎng)的引物，尤其是大于50個(gè)堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽?，可能需要純化?br>
引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。
探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時(shí)間可以高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。
由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。
3.4 熱啟動(dòng)
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如定點(diǎn)突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的熒光定量PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
Transitor? Hot Start Taq酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來說高效可靠。Transitor? Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會(huì)產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會(huì)被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會(huì)被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor? Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會(huì)被釋放到反應(yīng)中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。
3.5鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如DNA聚合酶的活性，這會(huì)影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會(huì)影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對(duì)于不同的引物對(duì)和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí)性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對(duì)鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用 Transitor? Hot Start Taq酶。Transitor? Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。
3.6 模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會(huì)抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時(shí)就會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR 反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR 反應(yīng)的成功率。
3.7 模板濃度
起始模板的量對(duì)于獲得高產(chǎn)量很重要。對(duì)大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，104到106個(gè)起始目的分子就足以觀測(cè)到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大小（下表）。舉例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當(dāng)于3×104到3×105個(gè)分子，足以檢測(cè)到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級(jí)的。對(duì)于一般的檢測(cè)樣品，10——100ng的量就足夠檢測(cè)了。當(dāng)然對(duì)模板做一個(gè)梯度稀釋，對(duì)于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。
表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例
基因組大小和分子數(shù)目的比例
3.8 防止殘余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源（非殘余污染）。
可以在PCR過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)PCR步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫?duì)照檢測(cè)污染。
使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。
一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因?yàn)榍懊娴臄U(kuò)增產(chǎn)物對(duì)UDG敏感，所有可以在PCR前對(duì)新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。
