微生物操作中常見問題的討論與分析
1、劃不出單個菌落的原因：
（1）平板上有過多的水分；
（2）劃線時接種環(huán)未經反復灼燒；
（3）多區(qū)劃線，三區(qū)或四區(qū)劃線。
2、涂布和傾注的區(qū)別：
涂布利于觀察，但由于涂布棒上會帶有少量的菌液，可能影響計數(shù)的準確性；傾注更為準確，但不利于觀察菌落的狀態(tài)。
Beuchat和Matsuda等人分別對這兩種方法作了大量比較試驗后發(fā)現(xiàn)，對霉菌計數(shù)來說，涂抹法有以下幾方面優(yōu)越于傾注法：
①培養(yǎng)出的霉菌菌落數(shù)較多；
②培養(yǎng)所需的時間較短；
③霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。
這是因為絕大多數(shù)霉菌是好氧的，在培養(yǎng)基表面生長快，發(fā)育好，而混在培養(yǎng)基中發(fā)育就受影響，而且在培養(yǎng)基傾注時霉菌孢子易受熱損傷。
3、培養(yǎng)基的選擇：
培養(yǎng)基的選擇應根據(jù)實驗材料和檢驗目的來確定。目前國標方法中使用的培養(yǎng)基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、孟加拉培養(yǎng)基(RBC)、高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)，其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長，而CAO則適合于高滲性霉菌生長，酵母菌幾乎不長。
在日常檢測中我們發(fā)現(xiàn)，有些常見的耐高滲性霉菌，如局限曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生長非常緩慢或不長，而這些菌在高滲培養(yǎng)基如M40Y、DG18(M40Y瓊脂配方：蔗糖400g，麥芽提取汁20g，酵母提取汁5g，瓊脂20g，氯霉素50mg，蒸餾水1000ml；DG18瓊脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，PH6.5)上則正常生長。孢子、形態(tài)特征發(fā)育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生長，因此，若能同時采用PDA和M40Y(或DG18)分離培養(yǎng)各類樣品中的霉菌，將能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特別是對干燥食品、高糖食品、淹漬食品等，更有必要同時采用M40Y或DG18。
由于霉菌中很多種類不會產生有毒的霉菌毒素，危害較小，而有的菌株即使污染數(shù)量不多，但其產生的霉菌毒素卻危害較大，因此僅作霉菌計數(shù)并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染食品的安全程度。
為此，國外有些研究者設計出各類選擇性培養(yǎng)基，可以識別產毒的霉菌。如AFPA培養(yǎng)基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH5.6)用于分離黃曲霉毒素產生菌高污染率的食品。產黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培養(yǎng)2~3天就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識別。有人利用該培養(yǎng)基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了滿意的結果。因此,針對不同樣品,有目的地設計出相應的選擇性培養(yǎng)基,以篩選污染菌中的危險菌群,將是一個值得探索的方向。
4、培養(yǎng)基配制時應注意的問題：
(1)滅菌溫度要嚴格控制，按照要求滅菌，尤其含糖量較高的培養(yǎng)基溫度不應太高，過高會導致糖分焦化，影響質量；
(2)瓊脂培養(yǎng)基不能反復溶化。反復溶化會破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；
(3)培養(yǎng)基不能反復滅菌，反復滅菌也會導致營養(yǎng)成分的破壞；
(4)含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌后，要搖勻。
5、平板的保存：
大多數(shù)平板如VRBA、DC、尿素酶生化管、顯色系列等要避光低溫保存。
6、產品的保存：
(1)干粉培養(yǎng)基：避光干燥，結塊后不能使用。
(2)亞碲酸鉀卵黃增菌液、50%卵黃乳液等：冷凍保存，使用時，要常溫解凍，避免水浴加熱。
(3)抗生素類：冷藏保存，溫度過高會導致靈敏度的下降。
(4)兔血漿：冷藏保存少量的紅色不會影響結果。
7、添加劑的添加：
（1）溫度的掌握。卵黃和抗生素類添加的溫度都不應太高。
（2）定量。過多會抑制一些目標菌，太少又導致雜菌的過度生長。
8、培養(yǎng)溫度的掌握：
（1）真菌類。25-28℃培養(yǎng)
（2）細菌類。李氏菌在增菌和生化中要求培養(yǎng)溫度在30℃左右。
（3）其他，一般在36℃左右。
9、接種方法：
常用的方法主要有劃線、三點接種、穿刺接種、傾注接種、涂布接種、液體接種。
10、革蘭氏染色方法：
染色時間的掌握、沖洗的方法。
11、生化實驗：
（1）接種的方法
（2）氧化型和發(fā)酵型實驗操作
（3）陽性菌種的對照
（4）接種前的純化。挑取單個菌落進行一系列的生化。
12、最適計數(shù)范圍
霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當擴散，在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交叉重疊，影響計數(shù)，但數(shù)量太少又會產生較大的誤差，因此選擇適當?shù)南♂尪扔嫈?shù)是保證結果準確的關鍵環(huán)節(jié)之一。
我們對這方面作了一些觀察研究，首先是將實驗菌株的斜面培養(yǎng)物制成含有約106個/ml的孢子懸液，并用血球計數(shù)器在顯微鏡下準確計數(shù)，然后將孢子懸液作10-1~10-6倍稀釋，吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA，25℃培養(yǎng)5天后計數(shù)。30種常見霉菌的兩種不同計數(shù)方法所得結果比較顯示，大部分菌株每平板含有10~50個菌落的稀釋度時的計數(shù)與顯微鏡計數(shù)結果最接近；有近一半的菌株，每個平板含50~100個菌落已較難計數(shù)，而大部分菌株，超過100個/平皿或小于10個/平皿的計數(shù)結果就與顯微計數(shù)結果存在較大差別，因此，應盡量選擇10~50個/平皿的稀釋度進行霉菌計數(shù)。
而對上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應在更少的范圍內計數(shù)(30個/平皿以內)。為控制霉菌的生長速度和菌落的生長范圍，可在培養(yǎng)基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，慶大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。
13、關于殺菌的幾個概念：
（1）抑制：是在亞抑制劑量因子作用下導致微生物生長停止，但在移去這些因子后生長仍可以恢復的生物學現(xiàn)象。
（2）死亡：在致死劑量因子的作用下或在亞致死劑量因子長時間的作用下，導致微生物生長能力不可逆喪失，即使移去這種因子后生長仍不能恢復的生物學現(xiàn)象。
（3）防腐：在某些化學物質或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施，它能防止食物腐敗或防止食物霉變。
（4）消毒：利用某種方法殺死或滅活物質或物體中所有病原微生物的一種措施，它可以起到防止感染和傳播的作用。
（5）滅菌：利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內的所有病原微生物的一種措施。
（6）化療：利用具有選擇毒性的化學物質，例磺胺、抗生素等對生物體內部被微生物感染的組織或病變細胞進行治療，以殺死組織內的病原微生物或病變細胞，但對有機體無毒害作用的治療措施。
