細(xì)胞數(shù)量確定
1.將細(xì)胞懸浮液（100μL/孔）接種在96洞孔板中。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。
2.向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數(shù)。
3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。
4.使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度。
細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性測定
1.將種子細(xì)胞以103-104個細(xì)胞/孔的密度在96孔板中在100μL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24小時。
2.將不同濃度的待測物質(zhì)加入板中。
3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r間（例如，6,12,24或48小時）。
4.使用重復(fù)移液器向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數(shù)。
5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。
6.在讀取孔板之前，重要的是在軌道振動器上輕輕混合1分鐘，以確保顏色均勻分布。
7.使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度。
數(shù)據(jù)分析
統(tǒng)計分析有幾種方法，您可以選擇使用O.D.值或細(xì)胞數(shù)量，我們提供其中一種方法。
細(xì)胞存活率（％）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As=實驗孔吸光度（含有細(xì)胞，培養(yǎng)基，CCK-8和待測化合物的孔的吸光度）。
Ab=空白孔吸光度（含有培養(yǎng)基和CCK-8的孔的吸光度）。
Ac=對照孔吸光度（含有細(xì)胞，培養(yǎng)基和CCK-8的孔的吸光度）。
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)。
2.使用培養(yǎng)基，等比稀釋細(xì)胞懸液為一個濃度梯度，通常需要5-7個濃度梯度，每組幾個復(fù)孔。然后接種細(xì)胞。（注意每孔的細(xì)胞數(shù)量。如果您將細(xì)胞懸液稀釋在管中，在加入培養(yǎng)板的孔之前，請小心再次混勻細(xì)胞。每孔中細(xì)胞懸液的體積應(yīng)該是一致的。）
3.培養(yǎng)直至細(xì)胞貼壁（通常2-4小時），然后每100μl培養(yǎng)基加入10μl CCK-8。繼續(xù)孵育1-4小時，用酶標(biāo)儀測量450nm處的吸光度。制作出一條以細(xì)胞數(shù)為X軸坐標(biāo)，O.D.值為Y軸坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
可以基于該曲線確定待測樣品的細(xì)胞數(shù)。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的先決條件是培養(yǎng)檢測條件相同。
注意事項
1.確保藥物和CCK8均勻分布在培養(yǎng)基中。
2.細(xì)胞增殖越多,顏色越深;細(xì)胞毒性越強，顏色越淺。
3.對于貼壁細(xì)胞，每孔至少需要1000個細(xì)胞（100μl培養(yǎng)基）。對于白細(xì)胞，由于靈敏度較低，每孔至少需要2500個細(xì)胞（100μl培養(yǎng)基）。推薦的96孔板每孔最大細(xì)胞數(shù)為25000。如果使用24孔或6孔板進行該檢測，請計算相應(yīng)的每孔的細(xì)胞數(shù)，并調(diào)整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10％。
4.因為CCK8測定是基于活細(xì)胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致實際活細(xì)胞數(shù)與使用CCK-8測定活細(xì)胞數(shù)之間有差異。
5.WST-8可能與還原劑反應(yīng)生成WST-8 formazan。如果使用還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
6.孵育2小時后，背景O.D.值一般為0.1-0.2單位。
7.注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.值。
8.如果您想對CCK8溶液進行滅菌，請使用0.2μm的膜過濾溶液。
9.孵育時間因孔中細(xì)胞的類型和數(shù)量而異。通常，白細(xì)胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（長達4小時）或大量細(xì)胞（~105細(xì)胞/孔）。
10.如果細(xì)胞懸液中存在高濁度,測量并減去樣品在600nm或更高波長的O.D值。
11.CCK8不能用于細(xì)胞染色。
12.培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
13.CCK8的毒性非常低，在CCK8測定完成后，相同的細(xì)胞可用于其他細(xì)胞增殖測定，例如結(jié)晶紫測定，中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細(xì)胞極為稀少，不推薦。）
14.該試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母細(xì)胞。
15.在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。
16.我們建議將細(xì)胞接種在靠近培養(yǎng)板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，可以用PBS，水或培養(yǎng)基填充這些孔。
17.如果您沒有450nm濾光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之間的濾光片,450nm濾光片具有最佳靈敏度。
18.測量450nm處的吸光度，如果您需要進行雙波長測定，作為參考波長可以測定650nm處的吸光度。
19.藥物中金屬離子的存在可能會影響CCK8的靈敏度。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。
